DNK kriminalistik taxlili jarayonida genetik profillarni aniqlash uchun fragment taxlil va sekvens taxlil usullari qoʻllaniladi.
DNK fragment taxlil usuli – oʻtgan asr 90-yillaridan boshlab keng qoʻllanib kelayotgan usul boʻlib, DNKning maʼlum bir soha(lokus)laridagi nukleotid ketma-ketliklarining qaytarilish miqdorini yuqori aniqlik bilan kapillyar elektroforez orqali aniqlash imkonini beradi. Ushbu usul vositasida yadro DNKsi markerlari, X va Y-xromosoma markerlari boʻyicha shaxs genotipi, gaplotipini aniqlash mumkin.
DNK sekvens taxlil usuli – oʻtgan asrning 1977-yillarida ishlab chiqilgan boʻlib, biopolimerlar – oqsil molekulasidagi aminokislotalar hamda yadroviy DNK, mitoxondrial DNK va RNK zanjiridagi nukleotidlar ketma-ketliklarini aniqlash imkonini beradi.
DNK fragment va sekvens taxlili uchun qoʻllaniladigan uskunalarni ikki davrga boʻlish mumkin. Sekvinslash birinchi avlodi(First generation sequencing)da Maks Gilbert usuli, Senger usuli va pirosekvinslash usullarini qoʻllanilagan. Ushbu usullar orasida Senger usuli hozirgi kungacha oʻz aktualligini qoldirmagan.
Dastlab DNK tekshiruvlarida xususan 1990-yillargacha fragment va sekvens taxlil vertikal gelelektorforez usulida olib borilgan. Bu jarayon uzoq vaqt va koʻp qoʻl mehnatini talab qilgan. Elektr maydoni kuchi taʼsiri natijasida akrilomid gelda DNK qandlifosforli qismi manfiy zaryadlanganligi sababli DNK zanjiri manfiy zaryadlangan katoddan musbat zaryadlangan anod tomon harakatlanadi (1-rasm). Uzun molekulalar gelda ushlanib qolganligi uchun nisbatan sekin, kaltaroq molekulalar esa tezroq harakatlanadi. DNK elektroforezi uchun odatda agarozali (DNKning nisbatan uzun molekulalari uchun) va poliakrilamid (DNKning qisqa molekulalarini aniqlash uchun, masalan, sekvenirlashda) gellari qoʻllaniladi.
1-rasm. Vertikal elektroforez sxemasi
DNK fragmentlari agarozali gellar odatda etidiy bromid bilan boʻyaladi, bunda dupleksning azot asoslari oʻrtasida interkalyatsiyalanadi va UB nurlarida yorugʻlik tarqatadi. Oʻlchamlarni aniqlash uchun maʼlum uzunlikka ega boʻlgan DNK ketma-ket fragmentlarini oʻz ichiga olgan DNK fragmentlari markerlarini (DNK ladder, “lineyka”) oʻzaro solishtiriladi. Marker chiziqlarining va noaniq oʻlchamdagi DNK fragmentlari chiziqlarining joylashishiga qarab uning uzunligi aniqlanadi.
2000-yillarga kelib kompyuterli avtomatizatsiyalashtirilgan sekvenatorlarni ixtiro etilishi DNK taxlilini vaqtini, qoʻl mehnatini va tannarxini arzonlanilishiga olib kelgan.
2-rasm. Avtomatlashtirilgan kapillyar elektroforez sxemasi
Bu turdagi genetik analizator(sekvenator)larda elektroforez jarayonida poliakrilamid geli bilan toʻldirilgan kremniydan ishlangan maxsus kapillyarlar orqali fluoressent boʻyoqli DNK molekulalari katoddan anod tomon xarakatlanish davomida SSD kameradan oʻtish vaqtida lazer deteksiyasi yuz beradi. Aniqlangan signal maxsus dasturiy taʼminot yordamida DNK zanjiridagi nukleotidlar ketma-ketliklari yoki muayayan koʻrsatgichlari bilan ifodalangan grafik tasviri olinadi.
3-rasm Seq Studio™ Flex Series Genetic Analyzer uskunasida fragment taxlil elektroforegrammasi koʻrinishi
Koʻpgina rivojlangan mamlakatlar DNK kriminalistik laboratoriyalarida shu jumladan X.Sulaymonova nomidagi RSEMda fragment va sekvens taxlil kapillyar gel elektroforez usuliga asoslangan avtomatlashtirilgan komplekslarda o‘tkaziladi. Dastlab 200 yildan 2005 yilgacha ABI PRISM 377 DNA uskunasida, 2005-2020 yillar davomida esa ABI PrismR 3100 Genetic Analyzer, ABI PrismR 3130xl Genetic Analyzers (Applied Biosystems) va hozirgi kunga kelib 3500 GeneticAnalyser, 3500xl GeneticAnalyser, Seq Studio™ Flex Series Genetic Analyzerda bir tadqiqot doirasida bir genetik marker boʻyicha fragment tahlil yoki mtDNK taxlili Senger usulida oʻtkazilib kelinadi. Ushbu uskunalar sekvenslashning birinchi avlodiga mansub boʻlib, ularning aksariyati AQSH hukumati tomonidan moliyalashtirilgan “Odam Genomi” loyixasi doirasida ishlab chiqlingan. Maʼlumot uchun, “Odam Genomi” loyixasi 1990 -2022 yyillar davomida AQSH, Buyuk Britaniya, Yaponiya, Xitoy va boshqa rivojlangan mamlakatlar olimlari tomonidan olib borilgan 2010-yillargacha loyixani amalga oshirish davomida Senger usuli boʻyicha sekvens taxlili olib borilgan. Usulni ixtirochisi Frederik Senger ximiya yoʻnalishi boʻyicha ikki marotaba Nobel mukofotiga sazovor boʻlgan. Birinchi bor u 1958-yilda Nobel mukofotiga insulin oqsilini strukturasini oʻrganish usullarini kashf etganligi uchun sazovor boʻlgan boʻlsa, 1980-yilda nuklein kislotalar, shu jumladan rekombinant DNK xususiyatlarini oʻrganish usuli kashf etganligi uchun sazovor boʻlgan. Nuklein kislotalar ketma-ketligini oʻrganish usuli “zanjir uzilishi usuli” nomi bilan ham mashhur. Usul DNK matritsaga komplementar zanjir sintezi davomida fluoressent belgili didezoksinukleotidlardan (ddNTP) birining birikishi natijasida reaksiyani toʻxtashi natijasida qadam va qadam DNK zanjiri ketma- ketligini oʻqish imkonini berishiga asoslangan. Senger usuli yordamida irsiy kasalliklarga olib keladigan mutatsiyalarni aniqlash mumkin.
Ushbu halqaro ilmiy loyiha davomida odam genomi toʻliq oʻrganilib chiqildi va quyidagi natijalarga erishildi: odam genomi 3164,7 million nukleotid juftlikdan(n.j.) iboratligi, oʻrtacha bir gen 3000 n.j. dan tashkil topganligi; loyiha olib borilgan davr ichida odam genomining faqatgina 50% genlar oʻrganilib, qolgan 50% oʻrganilishi davom ettirillayotganligi va jami oʻrganib chiqilgan genlar ichida 2% genlar oqsil sinteziga javob berishi aniqlangan.
4-rasm 3500xl GeneticAnalyser uskunasida sekvens taxlil elektroforegrammasi koʻrinishi
DNK kriminalistik taxlilida mt DNK aynan Senger usulida olib boriladi. Bu usulning eng katta kamchiligi koʻp vaqt davomida oʻtkazilishi hamda DNKning 1000 n.jgigacha uzunlikdagi frangmentlarini oʻkish imkoniyati mavjudligidadir.
DNK zanjirini 1000dan ortiq n.j. oʻqish uchun 2010-yillarda cekvinslashning yangi avlodi(NGS- Next generation sequencing) texnologiyalari ishlab chiqildi. NGS texnologiyasiga Illumina /Solexa firmasining “DNK reversiv terminasiyasi (DNK reversible termination)” usuli, ABI/Solid firmasining “DNKni ligirlash orqali sekvinslash(Sequensing by oligonucleotide ligation and detection)” usuli, Thermo Fisher firmasining “Ion Torrent uskunasida ion yarimoʻtkazgichli sekveslash( Ion semiconductor sequencing)”usuli va MGI firmasining DNBSEQ-G99RS uskunasida nanoshariklar (Rolling circle replication -dumalab ketayotgan halqa) sekvensiyasi usullarini misol keltirsak boʻladi.
Markazning Odam DNKsi sud biologik ekspertizasi laboratoriyasida hozirgi kunda XXRning MGI shirkatining “DNBSEQ-G99RS platform” uskunasida nanobollar yordamida “dumalab ketayotgan halqa” usulida ekspertiza tadqiqotlari olib borilishi yoʻlga qoʻyildi. Bu usul murakkab va odatiy DNK taxlili usullaridan tubdan farq qiladi. DNK taxlil jarayoni ikkita bosqichdan iborat boʻlib, birinchisi DNK kutubxonasini yaratishdan boshlanadi.
5-rasm “DNBSEQ-G99RS platform” uskunasida nanobollar yordamida “dumalab ketayotgan halqa” usulida tadqiqotlar olib borish sxemasi.
Bu bosqichda biologik materiallardan DNK ajratib olish, 1-PZR, amplikonlarni tozalash, 2-PZR, amplikonlarni tozalash va DNK kutubxonasini shakllantirish (adapterni ligirlash); DNK kutubxonasini miqdorini aniqlash; DNK kutubxonasidan pul(pool)yaratish bosqichlarni oʻz ichiga oladi. Tekshiruvlarning ikkinchi bosqichida esa, nanoshariklarni shakllantirish, jarayoni davomida DNK sirkulizatsiyasi(denaturatsiya, DNKni fermentativ tozalash; DNB(DNA nanoball) “yasash”; sintez jarayoni ketadigan adaptorga nanoshariklar(DNB)ni yuklashdan iborat. Sintez ketadigan yacheykaning ichida bir necha milliard zaryadlangan soxalar mavjud boʻlib, elekstrostatik kuch natijasida har bir sohaga bittadan nanosharik bogʻlanadi( sohalarning 90%toʻlishi taʼminlanadi).
XXRning MGI shirkatining DNK kriminalistik taxlili uchun maxsus “FOIR-IN-ONE” toʻplamini qoʻllash orqali bir vaqtning oʻzida 132 ta SNP markeri, 66 ta autosomal STR, 75 ta Y-xromasoma STR, 27 ta X-xromasoma STR va “ Mitoxondrial DNK HVR-I, HVR-II, HVR-III regionlari boʻyicha 300 ortiq genetik belgilar boʻyicha genetik profillarni aniqlash mumkin. Bunday natijalar ekspertiza natijasining ishonchlilik darajasini bir necha baravar ortishini taʼminlaydi.
Bundan tashqari hozirgi kunda Markazning Odam DNKsi sud biologik ekspertizasi laboratoriyasida “DNBSEQ-G99RS platform” uskunasida NGS texnologiyasi asosida murakkab turdagi qarindoshliklarni aniqlash; NGS texnologiyasi asosida fenotipik tadqiqotlarni oʻtkazish; NGS texnologiyasi asosida prenatal tadqiqot yoʻli bilan biologik otalikni aniqlash usullarini ishlab chiqish boʻyicha ilmiy ishlar olib borilib, yaqin vaqt ichida ekspert amaliyotiga qoʻllanilishi rejalashtirilgan.
Oʻzbekiston Respublikasi Adliya vazirli gi huzuridagi
X.Sulaymonova nomidagi RSEM Odam DNKsi sud biologik ekspretizasi
laboratoriyasi bosh eksperti D.Sh.Axmedova